Нас заинтересовала проблема - каким образом молекулы белка приобретают пространственную структуру, отвечающую функциональному назначению данного белка в клетке. Рассмотрим задачу по статье «Молекулярные дуэньи» Елены Павшук [123].
Описание процесса, эффекта, явления. Выдвижение гипотезы. "Простая цепочка из остатков аминокислот, соединенных амидными связями, изгибается, делает петли, завивается спиралью или укладывается зигзагами. Разные цепи или удаленные участки одной и той же цепи скрепляются нековалентными связями или дисульфидными мостиками по боковым SH-группам. Словом, образуется активная форма белка - фермент, катализирующий реакцию, структурный белок, вплетенный в волокно, рецептор на поверхности клетки, воспринимающий сигналы извне.
Генетический код - аминокислотные последовательности белков, записанные нуклеотидами ДНК и РНК - давно уже превратился из сенсации в аксиому. Но до сих пор не найдено решение одной из самых увлекательных задач современной биохимии - не расшифрована «вторая часть генетического кода», которая связала бы между собой линейную последовательность аминокислот и пространственную форму приобретаемую белком. (Вспомните, Гурвич хотел узнать, как растет организм, а мы сейчас хотим рассмотреть только форму белка).
Если каждая аминокислота в белке соответствует тройке нуклеотидов в ДНК его гена (примерно так же, как звук музыкального инструмента соответствует нотному знаку), то вся последовательность аминокислот - это мелодия, которая накладываясь сама на себя, должна создать такие гармонические созвучия, которые соответствуют «биологической функции» (то есть трехмерную структуру белка, способную выполнять свою задачу). Сравнение принадлежит американскому биохимику, лауреату Нобелевской премии Кристиану Анфинсену, экспериментально изучавшему эту гармонию и мелодии белка".
Вспомните 7 наших «нот». Белок сам отыскивает нужную конформацию, отвергая другую.
Проведение первого простого и изящного опыта. "Анфинсен поставил простой и изящный опыт. Препарат фермента рибонуклеазы подвергли химической денатурации - разрушали все дальние и ближние взаимодействия, стабилизирующие трехмерную структуру белка. Полипептидная цепь сбивалась в беспорядочный клубок со случайным набором связей, своим в каждой молекуле. Ферментативная активность препарата, естественно, резко падала. Интересно другое: после удаления денатурирующих агентов она восстанавливалась. Белок и вправду ренатурировал - находил нужную форму сам, причем не в клетке, а в пробирке, в водно-солевом растворе, не имел иной подсказки, кроме собственной аминокислотной последовательности. (Почему, как, где? - В.М.). Ответа нет. (Нет противоположного эксперимента. Не использованы аналогии, диссимметрия, ресурсы и т.д. - В.М.).
Поначалу опыты с другими белками, казалось, подтверждают выводы Анфинсена. Положение о спонтанной ренатурации белков вошло в учебники по биохимии.
Но вслед за правилом начали появляться исключения: не всем белкам удавалось вернуть утраченную форму - для некоторых условий денатурации так и не смогли подобрать. (Вот, что значит не провели противоположный эксперимент! - В.М.).
Конечно, активная форма любого белка просто обязана быть более стабильной, энергетически выгодной, чем неструктурированный белок. Однако начальные этапы верной и неверной укладки могут различаться по энергии незначительно. Тогда молекула случайно выбирает путь, сворачивания. Повезет - получится активная форма, не повезет...
Но полагается ли природа на везение? Или есть какие-то технологические секреты укладки, специальные приспособления, подсказки, помогающие в сложных случаях? (Это уже гипотеза - подсказка. - В.М.).
Секрет - это шаперон, дуэнья, посредник, но простой и активно участвующий.
Полипептидная цепь принимает форму, которую ей диктуют свойства, входящих в нее аминокислот. Важнейшая характеристика - отношение аминокислот к воде (гидрофильность, гидрофобность). (Диссимметрия - В.М.). В готовой глобуле или белковом комплексе, состоящем из нескольких субъединиц, гидрофобные участки цепей обычно упрятаны внутрь белка, подальше от молекул воды. (Диссимметрия - В.М.). А в водном окружении гидрофобные участки стремятся взаимодействовать друг с другом (Диссимметрия - В.М.). Могут соединяться и гидрофильные участки за счет образования водородных связей, электростатического притяжения разноименных зарядов. Участки белка, склонные к взаимному связыванию называют поверхностями взаимодействия.
Но порой эти поверхности взаимодействия проявляют излишнюю активность и могут образовывать «неправильные» связи. Тогда у молекулы начинаются неприятности - почти те же, что и у юной девицы, не обученной манерам.
Если неверная связь соединила два участка одной цепи, вместо ожидаемой активной формы возникает совсем другая, не обладающая нужными свойствами; как говорят, искажается углеродный скелет белка. Кроме того, белок со свободными связями, как и юная незамужняя барышня, не в чистом поле находится - в светском обществе других белков.
Достаточно столкнуться с каким-нибудь из них, также не достроившим свою трехмерную структуру, будь то зеленый новосинтезированный полипептид или потрепанный продукт денатурации, и... Совершенно верно - возникает незаконная связь между белками, они слипаются как попало! Тут без дуэньи не обойтись!
Попробуем перечислить случаи, когда белок можно застать в столь не прибранном виде - неуложенным, самыми интимными местами наружу. (Далее начинаются перечисления начальных условий или когда есть готовность к реакции. Я это опускаю. - В.М.).
Во-первых, сразу после рождения, белок, как известно, синтезируется на рибосоме наращиванием аминокислот от N-конца цепи (несущего свободную аминогруппу) к С-концу (несущего карбоксильную группу). Значит, из двух участков цепи, которые в готовом белке будут связаны, раньше появится тот, который ближе к N-концу, и, хочешь - не хочешь, какое-то время он будет открыт. А иногда и законченная цепь не торопится приобрести нужную форму и томно колышет обнаженными поверхностями связывания. (У дрожжей, к примеру, синтез одной белковой цепи занимает около двух минут, а укладка различных белков от миллисекунд до 2-х часов).
Во-вторых, когда белок просачивается через мембрану, он вынужден хотя бы частично развернуться - трехмерная структура просто застряла бы, как застревает в шитье узел на нитке.
В-третьих, многим сложным белковым комплексам по долгу службы приходится раз за разом собираться, потом разваливаться на отдельные субъединицы (в этот момент их участки связывания, естественно, открыты, хотя каждая из частиц ничуть не повреждена), а потом без ошибок собираться снова в нужном месте и в нужное время. Во всем этом кто-то должен им помогать.
В четвертых, и у клетки бывают стрессы, экстремальные ситуации вроде теплового шока. От перегрева белки теряют свою структуру, денатурируют, затем беспорядочно слипаются. Однако, тепловой шок (или хит-шок) не всегда губителен. Ответ живой клетки на перегрев - удивительное явление, клад для биохимиков и генетиков. (Это задачи, которые еще требуют решения. Далее идет перечень этапов, на которых возможны стрессы. Рассматривается влияние температуры близлежащих молекул и т.д. - В.М.).
Надо отметить, что новосинтезированный белок, который впервые приобретает свою трехмерную структуру, зачастую справляется с этой задачей лучше, чем тот же белок, утративший трехмерную структуру в течение жизни (Еще одна новая задача - почему? - В.М.) N - конец цепи, возникший прежде C - конца, далеко не всегда мешает - в некоторых случаях он управляет укладкой всего белка. Получается, что одна часть молекулы - наставник, а другая воспитанник. (Пример диссимметрии. - В.М.).
Кроме того, даже скорость синтеза может регулировать укладку. Какие-то участки цепи выстраиваются быстрее, какие-то медленнее, и это тоже становится подсказкой при поиске нужных связей. (Пример диссимметрии по скорости. - В.М.).
Но денатурированные белки лишены и таких подсказок.
В перечисленных ситуациях, критических для пространственной структуры белка, исследователи встретились с некими белками (Случайно или их предсказали, или их искали и нашли? - В.М.), которые выполняли, по-видимому, одну и ту же задачу у всех живых существ (от бактерии до человека) - снижали число ошибочных связей.
Наставницы невоспитанных белков. (А кто же собирает шапероны? - В.М.). В 1978г. слово «шаперон» впервые появилось в научной литературе - в статье посвященной белку нуклеплазмину из ядра яйцеклеток шпорцевой лягушки. Нуклеоплазмин регулирует сборку нуклеосом - бусин, на которые намотана ДНК в хромосоме и которые состоят из особых ядерных белков, называемых гистонами. Во время репликации ДНК, когда две ее нити расходятся и идет удвоение молекулы, нуклеосомы разобраны, а затем они формируются заново. (Раньше я думал, что ДНК не имеет оправки, а если она есть, то должно быть и взаимодействие - это диссимметрия – В.М.).
Так вот оказалось, что правильная сборка нуклеосом (бусин) возможна только в присутствии нуклеоплазмина, однако он сам в состав готовой нуклеосомы не входит. Нуклеоплазмин взаимодействует со свободными гистонами и, очевидно, экранирует их положительные заряды. После этого они уже не налипают как попало на отрицательно заряженную нить ДНК - идет аккуратная сборка. Итак, нуклеоплазмин уберегает своих подопечных от рискованных шагов, устраивает «подходящую партию» и, как только связи установились, скромно удаляется. И в самом деле - настоящий шаперон! Постепенно выяснилось, что белки, помогающие другим белкам формировать правильные трехмерные структуры - необходимая составляющая любой живой клетки. (Аналогия - катализ). В 1987г. Р. Дж. Эллис профессор университета в Ковентри выделил под общим названием - «шапероны» семейство таких белков. Список таких белков-шаперонов постоянно пополняется, но на сегодня подробно изучены представители четырех классов семейства (каждый из них объединяет белки, сходные между собой по аминокислотной последовательности). Это нуклеплазмины - родичи того белка, что первым получил название шаперона, шапероны-бактерии (и похожие на них шапероны высших организмов) и два класса шаперонов, названных по их представителям - белкам hsp70 и hsp90 (от Heat Shock Protein - белка, чей синтез начинается в ответ на повышение температуры; цифры означают молекулярную массу белка в килодальтонах). Шапероны теплового шока распутывают и восстанавливают денатурированные нагреванием белки.
Вскоре обнаружилось, что один и тот же шаперон может помогать сборке различных белков (хотя каждый шаперон, по-видимому, имеет ограниченный круг клиентуры). Более того, шапероны могут работать с белками - чужими для клетки. Поразительный пример - бактериальные шапероны cpn60 и cpn10, которые собирают из субъединиц фаговые частицы, иными словами, помогают размножаться вирусу, проникшему в бактерию. (Это означает, что те силы, которые образуются от зарядов (полей), работают независимо от природы вещества, а только от противоположных зарядов (полей).-В.М.). Вот что получается, когда молекулярной дуэнье не удается сдержать свой педагогический зуд и врага, на свою же голову, научит жить. (Этот факт имеет место и в жизни. - В.М.).
В отсутствие шаперонов фаги сформироваться толком не могут, их белки беспорядочно слипаются на клеточной мембране. Эти шапероны участвуют и в делении клетки, и в секреторных процессах и противостоят хит-шоку. (Не означает ли помощь врагу, что шапероны вынуждены это делать? - В.М.).
Так что же служит сигналом, дескать, белку требуется воспитательница? Возможно, шапероны распознают открытые поверхности взаимодействия, гидрофобные «пятна» в водной среде. Тогда, правда, непонятно, чем руководствуется шаперон, который разбирает белковые агрегаты (есть и такие). Но во всяком случае никакой конкретной информации о конечной структуре каждого своего воспитанника шаперон не имеет - не бывает, например, его пространственным негативом, формочкой для укладки. Скорее, связываясь с белком, шаперон облегчает ему правильную укладку тем, что затрудняет неправильную, - может быть, закрывает собой активные участки, способные к ошибочным взаимодействиям! (Все это - задача, а последнее - гипотеза. -В.М.).
Т.о. положение Анфинсена о самостоятельности ренатурации остается в силе. Профессор Эллис заметил по этому поводу: “В человеческом обществе шапероны также не обладали той информацией, которую люди используют при общении.”
Ведь наставница скромной девы не обязана что-то знать о будущем медовом месяце, о всяких ласковых прозвищах и поцелуях в носик. Ее дело - пресекать и искоренять все, что скромной деве не подобает. (А может для шаперонов есть свой источник их производства, по аналогии с эритроцитами? - В.М.).
Строение бактериального шаперона. Галантные биохимики, рассмотрев электронные микрофотографии бактериальных шаперонов (тех самых, которые помогают сборке фагов) сравнили увиденное с двойным пончиком (double donut), т.е. с двойным тором, бубликом. Два бублика, сложенные вместе, дырка к дырке - типичная структура многих шаперонов (рис. 60) из этого класса; так выглядят cpn60 пурпурной бактерии, GroEL кишечной палочки, шапероны митохондрий высших эукариот, шапероны хлоропластов. Каждый бублик состоит из семи или восьми субъединиц. На двух кольцах может лежать еще и третье, поменьше, - из семи маленьких субъединиц.
Рис. 60 Портреты и краткие биографии шаперонов [123].
Нелегкий труд шаперона требует затрат энергии, которую они получают от АТФ, причем связывание шаперона с белком усиливает его АТФазные свойства. Работу шаперона можно представить в виде нескольких этапов: предварительная частичная укладка белковой цепи, слабое связывание белка с комплексом АТФ - шаперон, гидролиз АТФ до АДФ и основная укладка белка, который прочно «залипает» на АДФ - шаперонном комплексе, замещение АДФ на АТФ и освобождение готового белка.
(По Зпчс энергия получается от АТФ. Один источник - и для белка и для шаперона, т.е. автор рассматривает процесс. - В.М.).
Какие-то детали этой картины могут оказаться упрощенными или невозможными, но, вероятно, в общих чертах она соответствует действительности. Мы упоминали о существовании шаперонов, которые не только препятствуют возникновению неверных связей, но и разрывают уже возникшие. (Сборка, разборка - прямой, противоположный. - В.М.). Именно так они распутывают конгломераты денатурированных белков, возникающие при хит-шоке или разбирают «правильные» белковые агрегаты, отслужившие свое. (Что значит отслуживший? Что он постарел? - В.М.).
Близкий родственник hsp70 - шаперон, принадлежащий к тому же классу, называется «раздевающая (un coating) АТФаза» А раздевает он (совмещая обязанности дуэньи и горничной) окаймленные везикулы - мембранные пузырьки, в которых разные вещества путешествуют по клетке. (Причем совмещение, объединение - раздевать помогать строить структуру - диссимметрия с противоположными свойствами - В.М.). Происходит это так: клеточная мембрана может натягиваться на любой каркас, принимая его форму, а такие каркасы строит белок клатрин (его субъединицы садятся на мембрану изнутри и сплетаются в широкую сеть с шестиугольными ячейками). Поскольку каждая субъединица слегка вогнута, то есть получается не плоская, а вогнутая внутрь клетки. (Аналогия - паук и его сеть для поимки мух. - В.М.).
По мере разрастания клатриновой сети мембрана тоже втягивается внутрь, и в конце концов кусок ее отрывается и замыкается в пузырек. А что в пузырьке? Все, что было возле мембраны по другую сторону от клатриновой сети. Вот так, например, амеба заглатывает капельку воды с питательным веществом. Этот пузырек, плывущий в клеточной цитоплазме, и называется окаймленной везикулой. (На электронных микрофотографиях они видны как кружочки с мохнатой клатриновой каймой, которая резко отличает их от пузырьков из «голой» мембраны). Но как быть, когда окаймленная везикула достигает места назначения? (Кто ее доставил, кто указал путь, кто заставил образовать везикулу? - В.М.).
Пузырек должен слиться с мембраной внутриклеточного отсека, чтобы забросить туда свое содержимое. Ясно, что первым делом надо удалить клатриновую оболочку. Здесь и начинается работа раздевающей АТФазы. Субъединица клатрина называется «трискелион» - трехножка по-гречески. Этими ножками трискелионы сцепляются друг с другом, образуя ячейки вогнутой сети. Шаперон, как и положено дуэньи, отжимает ножку от ножки, разрушает связи между мономерами и сеть рассыпается, освобождая мембранный пузырек. Одновременно шаперон ведет гидролиз АТФ, за что он и получил свое название.
(А куда делась мембрана? Куда делись трехножки? - В.М.).
Пока мы очень мало сказали о шаперонах, которые помогают белкам пролезать сквозь мембраны митохондрии и хлоропластов. Органеллы эти до известной степени автономны, у них, в частности, есть свой геном и свой аппарат белкового синтеза. Отсюда возникала гипотеза, утверждающая, что клетки современных растений или животных - продукт симбиоза: их митохондрии и хлоропласты могут быть потомками древних микроорганизмов, «проглоченных» и прирученных более крупной клеткой.
С тех пор, однако, организмы основательно отвыкли от вольной жизни. Многие белки, необходимые им, ныне закодированы в ядре, и синтезируются централизованно, вместе со всеми клеточными белками. Вот эти-то импортные белки органелл - продукция Большого Симбиотического Брата - и просачиваются через мембранные каналы в полуразвернутом виде. Значит, кто-то должен помочь белку развернуться перед выходом в канал, а кто-то принять белок внутри, придать ему правильную форму. (Вход-выход, выпрямление перед входом и свертывание после выхода. - В.М.).
Тут мы опять встречаемся со старыми знакомыми. Белки, которые направляются в митохондрии, развертывает hsp70, а внутри их встречает митохондриальный шаперон - «двойной пончик». И вот что интересно: шаперон митохондрии тоже закодирован в ядерном геноме и в митохондрию приходит снаружи, в развернутом виде. Оказалось, что шаперон сам нуждается в наставнике, чтобы обрести правильную форму! Если в митохондрии шаперон испорчен или его нет - сколько бы клетка ни синтезировала исправный шаперон, сколько бы его ни приходило сквозь мембрану, внутри он не сможет собраться в «пончик». Иначе говоря, чтобы импортировать шаперон в митохондрию, надо, чтобы он там уже был. Здесь нет противоречия: ведь органы клетки размножаются делением. (Все это любопытно! - В.М.).
Вывод. Итак, что же мы приобрели, познакомившись с шаперонами, наставниками белков?
Разглядели еще одну ступень на пути от линейного текста ДНК к разнообразным пространственным формам белков. Узнали, почему система искусственного белкового синтеза может выдавать совершенно неактивный продукт, хотя и без единой аминокислотной опечатки. (Может быть, теперь эту печальную для специалистов по белковой инженерии картину, удастся изменить, если к гену желаемого белка добавить ген шаперона или после синтеза белковой молекулы обработать ее шапероном? Тогда стало бы возможным получение многих лекарств, которые до сих пор не даются нам в руки).
А сами шапероны - как лекарства, а мутации в их генах - как причины болезней - все эти темы ждут своих исследователей. (Задачи! - В.М.). У млекопитающих, например, есть шапероны, регулирующие сборку антител. Интересно было бы узнать, как нарушение их работы отразится на иммунитете. Да и двусмысленные отношения бактериальных шаперонов с фагами внушает подозрения - вдруг шапероны высших организмов, в частности наши с вами, помогают вирусам?
Конечно, мы пока маловато знаем о молекулярных дуэньях. Остается неясным, как они находят своих воспитанников, что происходит между шапероном и белком в момент укладки цепи. Ну что же, загадочность к лицу столь романтической профессии. Создавать и разрушать связи всегда удобнее в сумерки и под густой вуалью. Проводим глазами соблазнительные очертания «двойного пончика» и подождем новых известий. Как знать, может быть, при более тесном знакомстве мадам Шаперон будет откровеннее".
В [124] описываются наблюдения о том, как белок принимает пространственную форму без участия шаперонов.
Опять весной мечты стесняют грудь,
Весна для жизни – свежая страница,
И хочется любить кого-нибудь,
Но без необходимости жениться.
Игорь Губерман [146].